|
Место трансплантации
клеток в экспериментальной и клинической медицине
В настоящее время трансплантация клеток
превратилась в новый способ изучения раннего эмбрио- и органогенеза, возникновения
и судьбы специализированных клонов в эмбриональных и фетальных тканях,
анализа взаимодействия клеток в развитии. Пересадки специализированных
соматических клеток используются с целью генной терапии или заместительной
клеточной терапии в случае фатальных иммунодефицитов, наследственных дефектов
клеточного метаболизма, а также острой функциональной недостаточности
органов. Практически вся пренатальная медицина построена на манипуляциях
с клетками и микромасштабной молекулярной диагностике. Специализированные
клетки крыс, человека и обезьяны стабильно выживают и функционируют в
организме иммунодефицитных мышей. Методы пересадки клеток играют все большую
роль во внутриутробной коррекции наследственных дефектов. Техникой трансгенного
включения и выключения генов in situ у животных созданы корректные
модели многих генетических болезней человека. Такие трансгенные линии
животных используются для апробации новых технологий переноса генов или
клеток с целью коррекции симптомов заболевания. Ряд технологий используется
в клиниках США и Европы для лечения острой печеночной недостаточности,
цирроза печени, наследственных дефектов метаболизма печени, системных
врожденных иммунодефицитов, нарушений гемопоэза, у пациентов с мышечной
дистрофией и дегенеративными заболеваниями нервной ткани, репродуктивной
системы, костной, хрящевой и покровных тканей, глаза, уха и других органов
чувств. На базе фетального материала тысячи биотехнологических компаний
создают биопродукты, биоматериалы для заместительной клеточной терапии,
установки для регенерации, а также искусственные органы для кратко- и
долгосрочного использования. Эти новые разработки фирм и крупных компаний
лицензируются и внедряются в медицину в виде весьма дорогостоящих новых
технологий. Например, подключение на 5-7 дней установки "искусственная
печень" для лечения пациентов с недостаточностью функции печени стоит
порядка 250 тыс. долларов. Примерно в ту же сумму обходятся пересадки
миобластов у пациентов с мышечной дистрофией и стволовых клеток у детей
с лейкемией.
Научно-практические исследования с фетальными тканями несколько
лет назад переживали фазу научных дискуссий, становления биоэтических
концепций и норм их проведения [21]. Но и тогда энтузиасты этого нового
направления в медицине стремились обратить внимание на поразительные результаты,
которых удавалось достичь у отдельных групп пациентов при лечении биохимических
и клеточных дефицитов с помощью пересадки фетальных клеток или материалами
на основе эмбриональной и фетальной ткани. Трудно перечислить все области
применения фетальных клеток и биопрепаратов на их основе в современной
медицине. Тысячи научных учреждений и клиник во всем мире практикуют сейчас
метод клеточной трансплантации. Ежегодно по этой теме публикуется огромное
количество статей и книг.
Цель данной статьи — попытаться систематизировать некоторые
наиболее важные аспекты этой проблемы за рубежом и в нашей стране, сделать
ее интересной как для экспериментаторов, так и для клиницистов [1].
Истоки направления
Общепринято считать родоначальником
фетотрансплантации русского врача-эмигранта С. Воронцова, который в 20-30-е
годы в Париже пытался пересаживать фетальные ткани в случаях преждевременного
старения. Хотя попытки С. Воронцова не принесли ему общепризнанного успеха
и популярности при жизни, в 1997 г. журнал "Тайм" поместил о
нем специальную статью. Через 50 лет роль С. Воронцова в закладке этого
нового направления медицины никем не оспаривается.
Медицина последних трех десятилетий создала серьезные научные предпосылки
для развития фетальной терапии и трансплантации клеток. Хирурги пришли
к идее пересадки клеток одновременно с пересадкой органа из-за огромного
дефицита качественного донорского материала. Экспериментаторы и клиницисты
искали пути уменьшения до разумного минимума количества трансплантируемой
фетальной ткани, стремясь помочь максимальному числу пациентов. В случае
болезни нервной и иммунной системы изначально лечение могло ограничиваться
лишь пересадкой клеток или небольшого объема ткани. Все чаще вместо свежей
фетальной ткани использовали биоматериал в виде стандартизированных линий
соматических клеток человека с улучшенными биологическими и пролиферативными
характеристиками. Источником стандартизированного биоматериала стали клеточные
банки. Биотехнологические компании и банки клеток занимаются клеточной
инженерией и конструированием искусственных органов. Клетки человека в
современной медицине являются не только важнейшей моделью, но и эффективным
средством изучения и лечения заболеваний человека.
Основные направления
Трансплантация клеток в настоящее
время развивается в трех главных направлениях: пересадка специализированных
соматических клеток, региональных (РСК) и эмбриональных (ЭСК) стволовых
клеток.
Терапевтические эффекты пересадок могут быть связаны с эмбриоспецифическими
ростовыми факторами, цитокинами и другими сигнальными молекулами, способными
активизировать регенерацию и выживание клеток в организме реципиента.
Предполагают, что введение фетальных клеток в организм взрослой особи
разными путями и с помощью сети сигналов активирует специализированные
и прогениторные клетки. Донорские и регенерирующие клетки реципиента частично
или полностью восстанавливают нарушенный молекулярный или клеточный гомеостаз.
Экспериментальные и клинические исследования стимулируют поиск новых классов
биологически активных соединений. Например, недавно открыты новые белки
фетальных клеток с высокой бактериостатической активностью, а также новые
иммуномодуляторы фетальных тканей, контролирующие иммунный ответ матери
на плод [23,31]. Важный аспект фетотерапии — замещение отсутствующих клонов
специализированных клеток в организме больного. Заместительная клеточная
терапия используется при восстановлении гемопоэза и иммунитета у пациентов
после радио- и химиотерапии, у пациентов с наследственными иммунодефицитами,
дефектами кроветворения и метаболизма. Лечение сводится к пересадке РСК
и формированию устойчивых ростков здоровой донорской ткани. В генной терапии
чаще всего используют РСК, трансфицированные соответствующими дефицитными
генами [5].
Если в 1990 г. в 143 центрах Европы проведено 4234 трансплантации
гематогенных стволовых клеток, то в 1994 г. – 10066 аналогичных трансплантаций
в 306 научных центрах, расположенных в 30 странах. За четыре года количество
пересадок алло/аутогенной ткани значительно возросло [14]. В середине
90-х годов число трансплантаций гематогенных стволовых клеток в 12 ведущих
странах Европы достигло 16-17 операций на 1 млн. человек [15]. Большинство
трансплантаций проведено при лейкемии, миелопролиферативных синдромах,
анемии, наследственных дефектах метаболизма.
Изучение терапевтических возможностей фетальных клеток привело
к открытию новых генов, контролирующих органогенез и образование РСК.
С помощью рекомбинационного выключения и вставок генов в развивающийся
зародыш удалось получить новый пласт информации о путях и механизмах сборки
клеток в органы. Эта информация сейчас активно используется для создания
искусственных органов, когда самосборка эмбриональных клеток осуществляется
in vitro в контролируемых химических условиях. Однако эффекты фетотерапии
не всегда сопоставимы с эффектами эмбриоспецифических молекул и РСК. Например,
анальгезирующие эффекты пересадок нервной фетальной ткани или иммуномодулирующие
эффекты трансплантации фетальных тканей на аутоиммунные процессы требуют
научного анализа. Применение фетотерапии во многих ситуациях одновременно
обгоняет фундаментальные исследования в этой области, что положительно
и отрицательно влияет на судьбу всего направления.
Почему трансплантация специализированных соматических клеток
пока не находит более широкого применения в клинике? В первую очередь
это связано с ограниченными возможностями трансплантации органов, с качеством
и количеством донорской ткани. Известно, что в США и Европе только 15-25%
пациентов получают адекватное лечение в виде пересадки гистосовместимого
органа. Потребности современной медицины только в донорской печени составляют
10 органов в год на 1 млн. человек. Не более 2 из 10 пациентов доживают
до спасительной операции, остальные погибают без радикального лечения.
С каждым годом количество больных, нуждающихся по жизненным показаниям
в трансплантации печени, почки или сердца, растет во всех странах одновременно
с заметным демографическим "старением" населения планеты, увеличением
хронических вирусных и экологических заболеваний. Трансплантацию соматических
клеток сейчас рассматривают о качестве главной альтернативы пересадке
органа. Например, пересадка гепатоцитов или 3-6-дневное подключение пациентов
с острой печеночной недостаточностью к "колонке" с искусственной
печенью дает время для поиска подходящего донорского органа. В недалеком
будущем такие "колонки" смогут обеспечить выживание пациентов
в острой фазе болезни и вернуть их к нормальной жизни.
Показательно, что пересадка лишь 3-5% гепатопитов компенсирует
практически любой наследственный метаболический дефект печени. Лишь трансплантации
клеток вполне достаточно для полной эффективной компенсации дефекта фермента,
белка-переносчика или белка-рецептора. Несмотря на низкую приживляемость
донорских гепатоцитов в печени или селезенке, прикрепленные донорские
клетки размножаются и формируют устойчивые ростки новой паренхимы в матриксе
селезенки или печени реципиента. Для увеличения эффективности имплантации
донорских гепатоцитов создают условия повышенной регенерации гепатоцитов
реципиента стимуляцией апоптоза или частичной ишемии органа. Внутривенное
введение рекомбинантного НGF (hepatocyte growth factor) пациентам с печеночной
недостаточностью почти на порядок понижает количество гепатоцитов в "искусственной
печени", необходимых для выживания пациентов. По-видимому, НGF стимулирует
одновременно имплантацию и пролиферацию донорских гепатоцитов и регенерацию
оставшейся паренхимы печени пациентов. Преимущество пересадки клеток связано
с возможностью повторных эктопических инъекций криопрезервированных клеток.
За последние годы получены бессмертные линии гепатобластов человека и
свиньи, которые хранятся в банках, стандартизированы по многим параметрам
и начинают применяться в лечебных целях. Наличие клеточных банков и специальных
бессмертных линий соматических клеток человека позволяют врачу уйти от
проблем биоэтики и смежных непростых вопросов использования абортного
материала в клинике. Существенно, что линии специализированных соматических
клеток лишены примеси ретикулоэндотелиальной ткани, которая содержит до
70% антигенов органа. Поэтому уровень иммунологических проблем в организме
реципиента значительно уменьшен по сравнению с пересадкой исходных органов.
Наконец, не последнюю роль играет и меньшая себестоимость
клеточных трансплантаций по сравнению с пересадкой целого органа. Стоимость
операции трансплантации печени в США и Европе колеблется между 250-350
тыс. долларов. Экономические соображения толкают на форсированное развитие
более дешевых клеточных пересадок в нашей стране.
В перспективе клеточные трансплантации обладают рядом важнейших
преимуществ по сравнению с пересадкой органов. Невозможность криопрезервации
паренхиматозных органов, необратимое повреждение сосудистого эндотелия
во время тепловой и холодовой ишемии, короткие сроки переживания паренхимальных
клеток in situ являются серьезными техническими барьерами, которые
пока не удается преодолеть науке.
Наибольшее количество проектов клеточной трансплантации соматических
дифференцированных клеток связано с генной терапией болезней человека.
Сюда относятся проекты лечения мышечной дистрофии Дюшенна пересадкой трансфицированных
миобластов. Наиболее перспективными оказались проекты пересадки фрагментов
гена дистрофина или гена утрофина — эмбрионального дистрофина мышц. Пересадки
ауто- и аллогенных трансфицированных линий миобластов не приводили к полному
излечению, но существенно тормозили прогрессирование заболевания. Работы
по созданию банков трансфицированных миобластов с высокой экспрессией
дистрофина в эмбриональных миобластах проводятся во многих лабораториях
и фирмах. Только в клинике проф. П. Лоу в Мемфисе прошли лечение методом
пересадки миобластов здоровых родителей более 350 пациентов из 20 стран
мира. По схеме П. Лоу пересадки миллионов донорских и реципиентных миобластов
на мышцу проводят с целью рекапитуляции эмбриогенеза мышцы. На ранних
фазах болезни в дегенерирующей мышце у пациентов-дистрофиков сохраняется
значительный пул миобластов, которые прямо в мышце сливаются со здоровыми
миобластами донора. В результате формируется химерный многоядерный синцитий,
а затем мышечная фибрилла, имеющая примерно равное число ядер здоровых
и больных клеток. Такое химерное волокно синтезирует дистрофии в количестве,
достаточном для восстановления основных функций мышечною волокна. При
сокращении мышцы не происходит разрушения плазматической мембраны и гибели
клеток. Химерные мышечные волокна оказались слабыми антигенами, что облегчает
их дальнейшее выживание.
Другим примером применения аллогенных
дифференцированных соматических клеток является пересадка изолированных
островков Лангерганса пациентам с инсулинзависимым диабетом. Известно,
что даже у нормальных людей численность островков, продуцирующих инсулин
в поджелудочной железе, ограничена 5-6*106 β-клеток. У
многих диабетиков дефицит островков обусловлен вирусной инфекцией и аутоиммунной
гибелью клеток. Эктопические пересадки аллогенных фетальных островков
человека и свиньи в ряде случаев дают устойчивую ремиссию заболевания.
Обычно эффективность трансплантации и длительность ремиссии зависят от
степени иммунотолерантности, которую удается достичь в отношении новой
имплантированной ткани. Во многих случаях пересадки эндокринной части
поджелудочной железы спасают пациентов от неминуемой гибели. Как известно,
отечественные ученые и хирурги добились неоспоримого приоритета в этой
области [3].
Пробные клинические пересадки фетального
яичника делаются в случае некоторых форм стерильности женщин, хотя на
этом пути имеется много нерешенных задач [8]. Проводятся клинические испытания
лечения гемофилии (наследственный дефицит фактора свертывания VIII или
IX) путем трансплантации миобластов или фибробластов, трансфицированных
соответствующим геном. На стадии клинических испытаний находится проект
генной терапии семейной гиперхолестеринемии, болезни Гоше, болезней отложения
липидов у пациентов с наследственным дефицитом гидролитических ферментов
лизосом.
Фетальные соматические клетки имеют
очевидные преимущества перед соматическими клетками взрослых доноров по
целому ряду причин. Во-первых, большинство фетальных клеток имеют слабо
экспрессированные комплексы главных антигенов гистосовместимости (МНС-I
и МНС-II), что на порядок уменьшает уровень посттрансплантационных осложнений.
Во-вторых, фетальные органы содержат в основном бластные и стволовые клетки,
наделенные мощным потенциалом пролиферации. Каждая пересаженная фетальная
клетка в благоприятном окружении способна дать самообновляющийся долгоживущий
росток функциональной ткани в организме реципиента. В-третьих, фетальные
и эмбриональные ткани, содержащие бластные популяции мезенхимальной и
специализированной ткани, привносят уникальный комплекс цитокинов и ростовых
факторов, которые стимулируют регенерацию донорской ткани. Ряд факторов
воздействует на региональные стволовые клетки и стимулирует частичную
рекапитуляцию эмбриогенеза. Например, 40% клеток фетальной печени составляют
РСК, более 58% — приходятся на бластные элементы, тогда как на долю дифференцированных
гепатоцитов приходится менее 1% клеток органа. Напротив, печень взрослого
человека на 99,8% состоит из популяций зрелых дифференцированных гепатоцитов,
синусных и купферовских клеток. Фетальные ткани 17-32 нед развития практически
полностью состоят из прогениторных клеток с высоким потенциалом миграции
и репопуляции. Каждая фетальная клетка имплантируется в 10-100 раз активнее
в тканях реципиентах и дает в 100-10 000 раз больше клеток в ростках по
сравнению с дифференцированными клетками человека из взрослых органов
[24]. Пул региональных стволовых клеток составляет менее 1% численности
клеток органа (если вспомнить, что взрослая печень содержит 109
клеток, то пул овальных бластных клеток насчитывает десятки миллионов
— огромный резерв для регенерации органа!). Медицина делает первые шаги
в сторону активного использования этих скрытых резервов здоровья.
Клетки человека для диагностики
и лечения
Создание генно-рекомбинантной технологии
промышленная наработка цитокинов и дефицитных ростовых факторов подготовили
тотальный переход экспериментальной медицины на "рельсы" клеточной
биологии. От опытов на животных эксперимент шагнул к культуре изолированных
соматических клеток человека. Наступил период изучения болезней человека
"в пробирке". Микромасштаб исследований позволил изучать "следы"
и "проявления" болезни в стерильной посуде, содержащей 105-106
клеток. Оказалось, что многие болезни человека имеют специфичные клеточные
изменения, отличные от животных (болезни репродуктивной системы, эндокринная
патология, старение, вирусные, нейрогенные, сердечно-сосудистые заболевания).
Начались испытания органотропных лекарств на культуре клеток органов человека.
Скрининг органотропных препаратов идет эффективнее и быстрее в микромасштабе
культуры по сравнению с соответствующими испытаниями на трех видах животных.
Многие фирмы давно внедрили культуру клеток человека для экспресс-скрининга
лекарств, поскольку такие испытания более экономичны, оперативны и информативны.
Кроме того, в последнее время на культуре изучают индивидуальные колебания
чувствительности индивидуумов к лекарствам (определение гипо- и гиперреспондеров).
Широко применяется культура клеток при изучении хронических повреждающих
агентов, малых доз радиации, синергизма и антагонизма лекарств, риск экологических
факторов в сложных биоценозах и т.п.
Первичные культуры соматических клеток
человека широко используются для генной и олигонуклеотидной терапии, подбора
векторов для переноса информационных молекул в клетки, а также для создания
устойчивых стандартизированных клеточных линий с постоянными заданными
характеристиками. В дальнейшем такие линии станут главным инструментом
в лечении болезней человека и будут распространяться клеточными банками
по медицинским учреждениям.
Огромную роль сыграли новые методы
диагностики на уровне единичных клеток (поточный сортировщик клеток, полимеразная
цепная реакция), которые широко используются для ранней внутриутробной
диагностики наследственных заболеваний и аномалий разлития плода.
Бессмертные клеточные линии с практически
неисчерпаемым резервом клеточных делений служат базой для биоинженерии
искусственных органов, которые могут быть собраны как in vitro,
так и в организме иммунодефицитных животных. В настоящее время созданы
и используются в практике несколько вариантов "искусственной печени",
"сосудистых протезов", искусственной костной и покровной ткани.
Однако следует признать, что клеточная биоинженерия органов пока делает
первые шаги.
Создаются специальные генно-модифицированные
линии гепатоцитов, миоцитов, стромальных клеток, миофибробластов, нейронов
и глии с целью пересадок и заместительной клеточной терапии. Эти клетки
имеют высокую инвазивность, пролиферативную активность для создания аллогенных
ростков здоровой ткани в организме реципиента и не опасны в плане канцерогенеза.
Проводится интенсивное изучение генов, сигнальных молекул и ростовых факторов,
контролирующих активное размножение и выживание донорских клеток в разных
тканях реципиента.
Региональные стволовые
клетки
Наиболее яркие примеры пересадок региональных
стволовых гематогенных клеток (РСГК) связаны с лечением наследственных
иммунодефицитов у детей (например, АДА-дефицита, обусловленного избирательной
гибелью клонов Т-лимфоцитов). Пересадки РСГК в костный мозг детей приводят
к постепенной стабильной репопуляции гематогенной ткани донорскими предшественниками
и миелоидными ростками вплоть до формирования нормальной полноценной популяции
зрелых лимфоцитов. Такая искусственно собранная "химерная" иммунная
система больного начинает нормально функционировать с постепенным исчезновением
симптомов иммунодефицита. Для лечения фатальных иммунодефицитов используют
РСГК, полученные из донорской пупочной вены или фетальной печени.
В 1995 г. весь мир облетела фотография
Джефа Гетти — первого больного СПИДом из Калифорнии, которому проводили
несколько сеансов трансплантации РСГК приматов для реконструкции его иммунной
системы. Известно, что иммунная система приматов имеет видовую резистентность
к вирусу СПИДа. Пересадки костного мозга обезьяны блокировали развитие
болезни у Гетти, хотя добиться полного функционального восстановления
иммунитета не удалось. Джеф Гетти является первым пациентом-"химерой",
искусственно собранным из ростков стволовых клеток обезьяны и человека.
Практика показала, что стволовые и дифференцированные клетки двух видов
млекопитающих могут не только сосуществовать, но и выполнять единые защитные
функции.
Уникальные возможности открывают пересадки
донорских РСГК в лечении болезней головного мозга, вызванных наследственным
дефектом ферментов лизосом и накоплением полимерных "шлаков"
в нервных клетках. Например, трансплантация РСГК от здоровых доноров приводит
к появлению в крови больных пациентов 10-15% донорских моноцитов. Донорские
моноциты постепенно проникают в головной мозг через гематоэнцефалический
барьер, где они трансформируются в популяцию нейроглии с нормальным количеством
лизосомальных ферментов. Подсчитано, что когда доля донорских здоровых
клеток микроглии достигает в головном мозге 3-5%, биохимические признаки
заболевания начинают исчезать одновременно со значительным улучшением
нейрологической симптоматики. Миграция нормальных донорских моноцитов
в мозг через гематоэнцефалический барьер создает новую популяцию микроглии.
Достаточно 5% нормальной микроглии для производства фермента, разрушающего
избыток цереброзндов в мозге, принадлежащих разным видам мышей.
Трансплантация нейрональных
стволовых клеток
Пионером нейротрансплантации считают
американского нейрохирурга Томпсона, который в середине прошлого века
делал пересадки нервной ткани в мозг животных в Нъю-Йоркском университете
[91]. Если в 1986 г. встречались единичные публикации по трансплантации
фетальных тканей в нервную систему, то в настоящее время тысячи хирургов
во всех развитых странах работают в этой области.
Главный прорыв в последнее десятилетие
связан с препаративным выделением, культивированием и созданием линий
нейрональных стволовых клеток (НСК). Долгие годы НСК не удавалось выделить
из мозга взрослых млекопитающих. Поиски НСК в головном мозге взрослых
особей казались бесперспективными, поскольку считалось общепринятым, что
мозговая ткань млекопитающих и человека не регенерирует. В частности,
это связывали с отсутствием НСК, способных производить новые популяции
нейронов. Однако из-за ограничений на макротрансплантацию нейрохирургия
первой перешла на рельсы молекулярных и клеточных вмешательств,
В отличие от мозга взрослых особей,
мозг фетусов I триместра беременности на 90% состоит из эмбриональных
прогениторных клеток. Даже в постнатальном мозге человека и млекопитающих
присутствует два пула прогениторных нейробластов, способных повторно интегрироваться
в нейронные сети эмбриона после трансплантации [18]. Линии нейрогенных
стволовых клеток, выделенных из мозга фетусов встраиваются в нейронные
сети мозга взрослой крысы [20].
В 1985 г. шведские неврологи опубликовали
первые положительные результаты лечения болезни Паркинсона пересадкой
хромаффинной ткани надпочечников в стриатум [6]. Полагают, что главные
клинические симптомы паркинсонизма (ригидность, браднкинезия, нестабильность
позы при вставании, остаточный тремор на 80% вызываются дефицитом дофаминов
в путамене. Это привело к многочисленным попыткам трансплантировать в
стриатум клетки, вырабатывающие дофамин. Фетальные дофаминергические нейроны
и хромаффинная ткань надпочечников использовались наиболее часто как самый
стабильный генератор медиатора [19]. Позднее было показано, что в мозг
могут транснлантироваться разные виды клеток, производящие дофамин. В
мозг пересаживали даже культуру феохромопитомы РС12. Эта культура вырабатывает
гораздо больше дофамина, чем фетальная нервная ткань. Под влиянием ростовых
факторов и местных условий клетки способны трансформироваться в популяции,
напоминающие нейроны. Это направление сейчас превратилось в специальный
раздел реконструктивной нейрохирургии во всех развитых странах. В качестве
источника дефицитного медиатора используют фетальную нервную ткань, культуру
нейронов, нейробластов, трансфипированные линии нейрональных прогениторных
клеток, фибробластов, миобластов и даже клетки дрозофилы. Изучение функций
мозга и лечение многих заболеваний нервной системы невозможно представить
без молекулярной и клеточной нейрохирургии. Это направление лидирует по
числу публикаций и катализирует появление новых идей и технологий [13,26,32].
Пересадка "маркерных" НСК в развивающийся мозг сейчас испильзуется
для изучения формирования отделов мозга, взаимосвязи сборки клеток с функцией
отдельных частей мозга [4]. Были открыты стволовые клетки нервной системы
и неизвестные ранее гены и цитокины, опосредующие. регенерацию головного
и спинного мозга после травмы и других повреждений.
Хотя пересадки фетальной нервной ткани
в мозг пациентов, страдающих болезнью Паркинсона или Хантингтона, в ряде
случаев указывали на перспективность минитрансплантации нервной ткани,
многие технические стороны операции оставались вне необходимых и воспроизводимых
стандартов качества при использовании абортной перивиталькой нервной ткани.
К тому же пересадки требовали большого количества фетальной нервной ткани,
которое удавалось получить сразу от 3-5 фетусов. Такие условия заготовки
донорской фетальной нервной ткани заставили искать альтернативные источники
нервных клеток для репарации повреждений головного и спинного мозга. Активно
велись работы но влиянию прекультивирования фетальной ткани с целью увеличения
выживания и активного встраивания бластных прогениторных клеток. Для этого
в культуру фетальной нервной ткани добавляли нейротрофины, ФГФ-2 и ФГФ-4,
факторы миграции клеток. Эти процедуры в ряде случаев повышали эффективность
пересадок. Порядка 4*105 живых фетальных бластных клеток в
зоне повреждения было достаточно для полного восстановления моторной или
сенсорной функции [22].
Следующий этап заключался в создании
нового биоматериала, который был наделен способностью повторять эмбриогенез
ткани в ограниченном участке мозга взрослой особи. Пересадка нейральных
стволовых клеток или прогениторных нервных клеток может преследовать разные
цели. По минимуму, пересаженные клетки должны обеспечивать региональный
синтез дефицитного медиатора, цитокина, ростового фактора, которые компенсируют
утраченную биохимическую функцию и защищают нейроны пациента от дальнейших
повреждений. "Программа-максимум" имеет в виду полное восстановление
утраченных нервных сетей за счет пролиферации донорских нейробластов и
образования новых нейронных сетей, состоящих из клеток пациента и донора.
Следует при этом учесть, что образование микроглии и васкуляризация имплантата
всегда идет за счет ткани реципиента.
Разработаны несколько путей получения
региональных стволовых клеток нервной ткани в культуре. Разработан метод
препаративного выделения очищенных стволовых региональных клеток головного
мозга крысы в первичную культуру. Добавление ростовых факторов в специально
подобранную культуру заставляло стволовые клетки делиться в 10-100 раз.
Убирая ростовые факторы и добавляя индукторы клеточной дифференцировки,
удавалось получить несколько миллионов нейробластов, продуцирующих дофамин.
Цитодифференцировка нейробластов сопровождалась образованием агрегатов
клеток с формированием нейритов, аксонов и специфических межклеточных
контактов. Однако для клинических пересадок требуется на 2-3 порядка больше
донорских нейробластов. Контрольные исследования на крысах с модельным
паркинсонизмом показали, что пересадки донорских нейробластов на 60-75%
снимают моторные расстройства и ригидность [30].
Нейробласты в культуре получают из
человеческих эмбриональных стволовых клеток линии Tera-1, Tera-2 и NTERA.
Первоначально эти бессмертные тотипотентные линии эмбриональных стволовых
клеток были выделены из клеток тератокарциномы, состоящей из гетерогенной
смеси малигнизированных примордиальных половых клеток. В отличие от нулли-потентных
линий тератокарциномы, из первичной культуры удалось изолировать несколько
линий бессмертных тотипотентных линий эмбриональных стволовых клеток,
которые сохраняют способность рекапитулировать эмбриогенез в составе зародышей-реципиентов.
Сначала клетки Tera и NTERA размножают
в специальной среде, содержащей ФГФ-2 и ФГФ-4, для получения биомассы.
Затем из среды убирают ростовые факторы и заставляют клетки прикрепляться
к коллагеновому субстрату, добавляя в качестве индуктора дифференцировки
ретиноевую кислоту (иногда гексаметилендиацетамид). Значительная часть
стволовых клеток в новых условиях погибает, другая приспосабливается к
условиям среды, формируя ионные каналы, рецепторы па поверхности плазматической
мембраны. Нейробласты начинают производить нейромедиаторы (обычно одного
типа). Превращение НСК в нейробласты регистрируют не только по биохимическим
и электрофизиологическим показателям, но и по поведению клеток в организме
животного-реципиента. Если введение клеток NTERA или Теrа в брюшную полость
(под кожу) ведет к образованию метастазирующих опухолей, то нейробласгы
теряют потенцию к неограниченному росту и не дают злокачественных метастазов.
Наиболее характерным маркером НСК считают нестин — ранний специализированный
белок, который образуется на стадии нейроэпителиальных клеток [12].
Иммортализованные линии нейрональных
стволовых клеток, вырабатывающие ростовые факторы и кофакторы регенерации,
блокаторы апоптоза, сигналы цитодифференцировки широко используются в
экспериментах на животных с целью компенсации механических, химических
и вирусных повреждений спинного и головного мозга [21]. Долгое время считалось,
что такие острые повреждения необратимы из-за отсутствия пролиферации
нейронов в зоне гибели и невозможности повторного роста аксона у нейронов.
Причину искали в свойствах окружающей астроглии, блокирующей регенерацию
нервных клеток. Однако последние эффективные пересадки фетальных нервных
тканей и иммортализованных клегок в поврежденный спинной мозг доказывают
возможность восстановления нервных связей мотонейронов, если имплантат
размещали дистальнее повреждения [17]. Столь же эффективными оказались
пересадки нейробластов в разные зоны механически поврежденного головного
мозга [11]. Оказалось, что донорские нейробласты, имплантированные в разную
тканевую среду обитания, способны превращаться в разные специализированные
клоны нейронов и нейроглии, причем факторы окружающей среды существенно
контролировали направление специализации клеток. Самое удивительное, что
донорские линии нейробластов устойчиво формируют "химерные"
нейронные сети из донорских и реципиентных клеток в месте повреждений
и регенерации. Это подтверждает предположение, что регенерация нервной
системы взрослых особей может быть значительно восстановлена за счет добавления
"пришлых" эмбриональных нейробластов. Последние результаты показывают.
что стандартные банковские линии НСК, полученные из ЭСК, обладают целым
рядом преимуществ в лечении посттравматических повреждений спинного и
головного мозга в эксперименте и клинике [27]. Интралтомбарное введение
иммортализованных серотонинергических линий нейробластов, обеспечивающих
постоянно высокую концентрацию ингибиторного медиатора, давало устойчивый
обезболивающий эффект у крыс [10].
НСК для лечения инсульта
Кровоизлияние в мозг (инсульт) является
тяжелым осложнением гипертонии и атеросклероза в пожилом возрасте. Локальное
нарушение кровоснабжения отдельных зон мозга приводит к потери речи, параличу
мыщц конечностей. Из-за необратимой гибели нервных клеток пациенты после
инсульта становятся инвалидами до конца жизни. В течение нескольких лет
ученые фирмы "Leiton Bioscience" изучали, как эмбриональные
бессмертные стволовые клетки способны превращаться
в НСК и популяции нервных и глиальных клеток. На мышах и крысах эксперементаторы
сумели в деталях изучить, каким образом своевременная пересадка эмбриональных
нейробластов в поврежденный мозг животных способна восстанавливать утраченные
нейронные цепочки. Взамен погибших участков ткани эмбриональные клетки
строят участки гибридных нервных сетей из донорских и реципиентных нейронов.
Важно при этом, что происходит блокада развития рубцовой ткани, которая
вытесняет нервную, блокируя регенерацию. Именно развитие рубца в мозговой
ткани обусловливает необратимость заболевания.
После многочисленных экспериментов
животных были найдены условия, при которых своевременная пересадка донорских
эмбриональных нейронов защищала мозг от функциональных повреждений. Наконец,
испытания животных были закончены и наступило сам трудное — первые попытки
лечения людей. В Питтсбурге пациентка и ее семья дали согласие на пересадку
нейронов, поскольку ей грозила тяжелейшая инвалидность. 23 июня 1998 г.
в Питтсбурге проведена пересадка НСК 62-летней женщине, у которой после
инсульта развился односторонний паралич конечностей и была полностью потеряна
речь. Впервые в истории медицины была сделана пересадка НСК прямо в зону
гибели нервных клеток с целью восстановления утраченных нейронных сетей
в пострадавшей ткани мозга. Поскольку нейроны взрослого мозга не делятся,
для реставрации утерянной архитектуры клеток использовали НСК, которые
"обучены" повторять сборку нервной ткани во время эмбрионального
развития. В операции использовали новую линию НСК, полученную американской
биотехнологической компанией "Leiton Bioscience". После пересадки
эмбриональных донорских нейронов удалось на 50-60% восстановить речь и
двигательную активность. Половина успеха операции была связана с качеством
нервных клеток, предоставленных учеными компании "Leiton Bioscience".
Несколько линий примордиальных половых клеток были выделены ранее из метастазов
опухоли молодого человека. Удача ученых заключалась в том, что изолированная
и размноженная новая линия ЭСК оказалась способной повторять эмбриогенез
в культуре, а также создавать НСК в контролируемых химических условиях.
Важно подчеркнуть, что великолепный клинический эффект был получен буквально
с первой попытки. Это говорит о том, что клеточная пересадка в поврежденный
мозг животных действительно себя оправдывает и дает основания для передачи
метода в клинику. Многие специалисты считают, что эта операция, проведенная
23 июня 1998 г., останется в истории нейрохирургии, как и операция первой
пересадки печени человеку, которая также была проведена в Питтсбурге и
1967 г. Данные эксперимента и клиники показывают, что идея восстановительной
хирургии периной ткани путем повторения эмбриогенеза не является химерой.
Для повторной починки мозговой ткани человека необходимы лишь специальные
биотехнологии и ресурсы. Не вызывает сомнений, что этим путем и будет
далее развиваться реконструктивная микрохирургия, опирающаяся на законы
клеточной биологии.
Фетальная терапия при синдроме Дауна и хрупкой Х хромосоме
С помощью генетического картирования
удалось локализовать специальную группу генов на дистальном плече 21-й
хромосомы, которые ответственны за характерные аномалии постнатального
развития мозга при болезни Дауна (лишней 21-й хромосоме). Гибридизационный
анализ показал, что один из важных генов этой группы является гомологом
гена sim дрозофилы, который ответствен за развитие головы мушки [25|.
Наиболее полезными маркерами внутриутробной диагностики плодов с синдромом
Дауна является повышенный уровень Α-фетопротеина, неконъюгированных
эстриолов и хорионического гонадотропина в крови матери. Замедленный рост
костей плеча и предплечья может служить ранним предвестником болезни.
Трансгенная пересадка "даун-группы"' из 20 генов дистального
плеча 21-й хромосомы мышам ведет к появлению нарушений, сходных с функциональными,
постнатального формирования мозга. Эти гены контролируют не только упрощение
карты нейрогенеза и формирование извилин коры больших полушарий по более
примитивной схеме, но и общую задержку роста детей. Для синдрома Дауна
характерна небольшая скорость созревания нейронов, их ограниченный репертуар
и повышенная гибель, избыточное образование белка S-100, супероксиддисмутазы,
ОК-2 и β-А4-амилоида, гены которых локализованы в ''даун-группе"
[17]. Наиболее важными клеточными проявлениями болезни Дауна в развивающемся
мозге являются гибель, недоразвитие межклеточных сетей нейронов с компенсаторным
разрастанием глиальных популяций. Предполагают, что эти клеточные изменения
вызваны дисбалансом генов, локализованных на длинном плече 21-й хромосомы.
Пока совершенно неясно, как реализуется этот дисбаланс генов в клетках
развивающегося мозга человека и млекопитающих. Мы исходили из предположения,
что в случае травмы, инфекционных поражений и нейродегенеративных процессов,
стимуляция регенерации бластных элементов мозга с помощью локальных и
системных подсадок фетальных тканей может частично сбалансировать действие
лишней "дозы" генов, в том числе на рост и скорость общего развития
ребенка. На трансгенных мышах с лишней "дозой" гена белка S-100
в развивающемся мозге обнаружен системный глиоз с дегенерацией нейронов
[28].
На крысиной модели синдрома Дауна
было показано, что прогрессивная дегенерация нейронов головного мозга
может быть существенно задержана системным введением ростового фактора
нейронов (NGF) [16]. Сходные клинические проявления и нейрологическая
симптоматика развиваются у пациентов с синдромом хрупкой Х хромосомы [29].
В этом разделе нейробиологии следует ожидать быстрого прогресса, который
поможет более обоснованно использовать фетальную терапию.
Эмбриональные стволовые
клетки
Огромный прогресс достигнут в использовании
ЭСК, которые обнаружены в ранних зародышах млекопитающих в виде двух независимых
популяций. Это, во-первых, линии бессмертных ошаренных недифференцированных
клеток, получаемых от предимплантационных зародышей млекопитающих. Клетки
этого происхождения сохраняют тотипотентность и признаки бессмертия при
соблюдении следующих условий: они должны культивироваться в жидкой среде
над слоем фидерных клеток, который блокирует взаимодействие ЭСК с подложкой.
Во-вторых, эти клетки для сохранения незрелого состояния нуждаются в добавлении
трех цитокинов — LIF, SCF и ИЛ-3. Эти сигналы принуждают весь хроматин
ЭСК находиться в неактивном состоянии. Практически идентичными свойствами
обладают линии тератокарциномы человека и млекопитающих, выделенные из
спонтанно возникающих опухолей яичников.
Другой вид ЭСК получают из герменативных
зародышевых клеток, возникающих вне зародышей млекопитающих и человека
на стадии, когда основные органы зародыша еще не сформированы. Эта уникальная
популяция ЭСК затем мигрирует из желточного метка к половому бугорку,
где будут формироваться провизорные половые органы зародыша. Фактически
примордиальные половые зародышевые клетки не являются "собственностью"
зародыша. Скорее зародыш является временным носителем бессмертных зародышевых
клеток, которые транзитом передаются из поколения в поколение. В настоящее
время получены многочисленные бессмертные линии ЭСК человека и млекопитающих
из пула примордиальных зародышевых клеток. Наиболее важное свойство ЭСК
— способность к полной рекапитуляции эмбриогенеза в организме псевдобеременной
самки. С помощью ЭСК удается преодолевать межвидовые барьеры и получать
животных, состоящих из нескольких исходных родительских клонов.
Такие лабораторно собранные зародыши
проходят эмбриогенез без отклонений. Рождаются нормальные мышата, у которых
соотношение белых и черных пятен на шерсти соответствует числу исходных
стволовых клеток. По мозаике кожи можно ориентировочно судить о степени
клеточного химеризма в других органах.
Получены несколько линий ЭСК человека,
но на лабораторные манипуляции с этими клетками Конгресс США наложил мораторий.
Наиболее часто ЭСК используются сейчас для получения РСК: нейрональных
прогениторных клеток, кардиомиобластов, миобластов скелетных мышц, мезенхимальных
стволовых клеток, бластных линий энтодермальных органов. Многие биотехнологические
компании занимаются созданием бессмертных РСК животных и человека, которые
при введении в ткани способны рекапитулировать эмбриогенез и создавать
новые устойчивые ростки специализированных клонов.
Наконец, с помощью ЭСК удается осуществлять
массовое тиражирование эмбрионов — генетических близнецов. Описаны эффективные
способы клонирования зародышей мышей с идентичным геномом, причем тиражирование
идентичных зародышей получено в третьем поколении одного клона мыши с
абсолютно идентичным геномом. В будущем клонированные линии животных будут
необычайно полезны для изучения эффектов генов и окружающей среды.
Резюмируя все сказанное, следует признать,
что создание национального банка ЭСК и РСК является наиболее приоритетным
направлением нашей работы, поскольку клеточный банк с его инфраструктурой
и сервисом может стать к 2000 году главным интегрирующим центром объединяющим
и унифицирующим всю научно-практическую деятельность в России, направленную
на разумное и научно-обоснованное использование трансплантации клеток
в медицине ближайшего десятилетия. Создание банка клеток позволит отделить
научные поиски и разработки новых биотехнологий от проблемы заготовки
и использования абортного материала, создаст устойчивый фундамент для
теоретических и прикладных работ с эмбриональными и фетальными клетками.
Банк организует экономическую и научную инфраструктуру для развертывания
новых направлений и поисков в медицине XXI века.
ЛИТЕРАТУРА
1. Репин B.C.,
Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. - М., 1998.
2. Трансплантация фетальных тканей и клеток человека. /Под ред. Г. Т.
Сухих и Л.Н. Ерина. - М., 1996.
3. Шумаков В.И., Блюмкин В.И., Скалецкий Н.Н. Трансплантация островковых
клеток поджелудочной железы. - М., 1995.
4. Aivarez-Otero R„ Sotelo С., Alvarado-Mallart R.M. // J Comp. Neurol.
- 1993. - Vol. 333. - P. 597-616.
5. Anderlini P., Korbling М. // Stem Cells. - 1997. - Vol. 15.- P.9-17.
6. Backlund E.О., Granberg P.O., Hamberger B. et al. // J Neurosurg. -
1985. - Vol. 62. - P. 169-173.
7. Becker L.E., Mito Т., Takashima S. et al. // APMIS Suppl. - 1993. -
Vol. 40. - P. 57-70.
8. Berkowitz J.M. // J. Med. Ethics. - 1995. - Vol. 21. - P. 298-304.
9. Cell and Tissue Transplantation into the Adult Brain. / Ann. N.Y. Acad.
Sci. - 1997. - Vol. 495. - P. 360.
10. Eaton M.J., Santiago D.I., Dancausse H.A.et al.//Pain. 1997. - Vol.
72. - P. 59-69.
11. Ffench-Constant C., Mathews G.A. //J. Neurol. - 1994. Vol. 242. -
P. S29-S32.
12. FischerF.J. //Neurobiol. Dis. - 1997. - Vol.4. - P. 1-22
13. Freeman T.B., Olanow C.W., Hauser R.A. et al. //Ann. Neurol. - 1995.
- Vol. 38. - P. 379-388.
14. Gratwohl A., Hermans J., Baldmero H. // Bone-Marrow Transplant. -
1996. - Vol. 17. - P. 137-148. 15. Gratwohl A., Hermans J., Baldmero H.
el al. // Br. J. Haematol. - 1996. - Vol. 92. - P. 35-43.
16. Holtzman D.M., Li Y., Chen K. et al. // Neurology. - 1993. - Vol.
43. - P. 2668-2673.
17. Horvat J.С. //Bull. Acad. Natl. Med. (Paris). - 1994. - Vol. 178.
- P. 455-463.
18. Jankovski A., Rossi F., Sotel C. // Eur. S. Neurosci-1996. -Vol.8.
-P. 2308-2319.
19. Kordower J.H., Liu Y.T., Winn S. et al. //Cell Transplant. - 1995.
-Vol. 4.- P.155-171.
20. Lundberg C., Field P.M., Ajayi Y.O. et al. // Brain Res. - 1996. -Vol.737.
-P. 295-300.
21. Martinezserrano A., Bjorklund A. // Trends Neurosci. - 1997. - Vol.
20. - Р. 530-538.
22. Mehta V., Hong M., Spears J. et al. // J. Neurosurg. - 1998. -Vol.
88. - P. 1088-1095.
23.Messner R.P. // J. Rheumatol. - 1997. - Vol. 24. -P. 819-821.
24. Migliaccio G., Baiocchi M., Hamel N. // J. Chemother. -1996, -Vol.
5.- P. 161-179.
25. Muenke M.. Bone L.J., Mitchell H.F. et al. // Am. J. Hum. Genet. -
1995. - Vol. 57. - P. 1074-1079.
26. Nikkah G., Cunningham M.G., Judicke A. et al. // Brain Res. - 1994.
- Vol. 633. - P. 133-143.
27. Onifer S.M., Cannon A.B., Whittemore S.R. // Cell Transplant. - 1997.
- Vol. 6. - P. 327-338.
28. Reeves R.H., Yao J., Crowley M.R. et al. // Proс. Natl. Acad. Sci.
USA. - 1994. - Vol. 91. - P. 5359-5363.
29. Rousseau F., Rouillard P., Morel P. et al. // Am. J. Hum. Genet. -
1995. -Vol. 57. - P. 1006-1018.
30. Studer L, Tabar V., McKay R.D.G // Nat. Neurosci. -1998. -Vol. 1.
- P. 290-295.
31. Van de Putte L.B., Tyndall A, Van den Hoogen F. H. et al. // J. Rhematol.
Suppl. - 1997. - Vol. 48. - P. 98-99,
32. Widner H. // Acta Neurol. Scand. Suppl. - 1993. -Vol. 146. - P. 43-45.
вернуться к началу раздела
|