Абстракт

Описана методика получения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга. Показана возможность их направленной дифференцировки во время культивирования в адипоцито и миоцитоподобные клетки. Выражена уверенность в целесообразности трансплантации клеток костного мозга для осуществления клеточной терапии поврежденных органов.
The technique of getting mesenchymal stem cells from bone marrow is described. The opportunity of the directed differentiation of these cells into adipocyte-like and myocytes-like cells during cultivation is shown. The confidence in expediency of mesenchymal stem cell transplantation for carring out therapy of injured organs is expressed.

На протяжении последних 20 лет лечение тяжелых форм органной недостаточности: инсулинозависимого сахарного диабета [5,6], первичного послеоперационного и аутоиммунного гипотиреоза, острой и хронической печеночной недостаточности различной этиологии [4], включая гепатоцеребральную дистрофию – болезнь Вильсона [2], а также лечение гнойно-септических и аутоиммунных заболеваний проводилось нами с использованием соматических дифференцированных клеток донорских органов того же фенотипа. При выборе донорского материала предпочтение отдавалось фетальным, неонатальным органам, гиперплазированным тканям (щитовидная железа), а также тканям с высоким уровнем обновления клеток.

Начиная с 1997 года для регуляции восстановительных процессов в поврежденных органах и тканях различного фенотипа стала использоваться лимфоидная ткань (селезенка) [1], которой по современным представлениям присуща не только иммуногенетическая, но и морфогенетическая функция.

Несмотря на клиническую эффективность проводившейся клеточно-тканевой терапии, метод не получил должного распространения прежде всего из-за острого дефицита аллогенного донорского материала, а также эпидемиологической и иммуногенетической опасности использования его ксеногенных источников.

В последнее время мы обратились к исследованию донорских возможностей костного мозга (КМ), который за счет морфогенетической функции своих лимфоцитов, а также гемопоэтических стволовых клеток способен обеспечить регуляцию восстановительных процессов в органах различного фенотипа: в почках при нефротическом синдроме [3], в печени при токсическом повреждении [12], дислипидемии и атеросклерозе [9] и т.д.

Наш интерес к использованию клеток КМ усиливался не только возможностью его аутогенного применения для регуляторной поддержки процессов восстановительной регенерации поврежденных органов и тканей, но и возможностью возмещения дефицита клеток в тканях, которые имеют мезенхимальное происхождение.

О мезенхимальных стволовых клетках (МСК), из которых образуется ретикулярная строма КМ, известно слишком мало. Доказано, однако [14], что МСК присутствуют во взрослом костном мозге, могут пролиферировать как недифференцированные клетки, имеют фибробластоподобный фенотип в культуре и образуют монослой, а так же обладают способностью дифференцироваться в ткани мезенхимального происхождения, такие как: кость, хрящ, жир, сухожилия, мышцу и строму [14]. По данным [7] эти клетки проявляют способность к дифференцировке в нейрональном и глиальном направлении.

МСК несут на своей поверхности такие антигенные детерминанты как: SH2, SH3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a, CD124, но не имеют CD14, CD34, CD45 и CD68. [13,15], которые присущи гемопоэтическим стволовым клеткам. При трансплантации МСК в ткани они дифференцируются в тот клеточный фенотип, который присущ данной ткани, и это связывают с воссозданием для них соответствующего тканевого микроокружения [8,10,11]. Приступая к исследованию возможности использования МСК для восстановительного лечения органов, мы считали необходимым, прежде всего, определить условия направленной дифференцировки этих клеток в культуре после выделения их из КМ.

Забор клеток костного мозга проводили у взрослых крыс породы Вистар под эфирным наркозом. Клетки получали из берцовых костей с промыванием полости кости забуференным физиологическим раствором (ЗФР), содержащим гепарин и гентамицин, объемом 0,5 мл с помощью иглы 16G, насаженной на шприц. Суспензию клеток центрифугировали 5мин при 1500 об/мин, осадок клеток ресуспендировали в лизирующем растворе в течение 3 мин и центрифугировали 3 мин при 1500 об/мин. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок МСК ресуспендировали в ростовой среде Iskov’s (Gibco, Grand Island), содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки (HyClone, USA), и другие добавки. Клетки культивировали 1,5-2,0*106 кл/мл на чашках Петри d=30мм при 370С в СО2-инкубаторе, атмосфере с 5% СО2 и 95% влажности 2-3 суток. В половине клеточных культур, в конце третьих суток в среду вносили специфические факторы дифференцировки на 24 часа [15], для направления дифференцировки МСК в миоцитоподобные. Через сутки инкубации среду полностью заменяли на ростовую среду с факторами роста, как у культур обработанных, так и не обработанных дифференцировачными факторами. Среду заменяли через каждые три дня во всех культурах, длительность культивирования составила свыше двух месяцев. При достижении плотного монослоя и появлении адипоцитоподобных вакуолизированных клеток культуру рассевали 1:3, используя стандартный раствор трипсина (2,5 г) на Хэнксе без Mg2+ и Са2+ (Sigma, USA).

Для иммуногистохимического исследования миоцитоподобной дифференцировки МСК, клетки фиксировали 100% метанолом при  20С в течение 20 минут. После промывания ЗФР клетки инкубировали с раствором, блокирующим неспецифическое связывание иммуноглобулинов, содержащим 3% лошадиной сыворотки в течение 10 минут. Далее после трехкратного промывания ЗФР клетки инкубировали с мышиными моноклональными антителами к тропонину I (антитела были любезно предоставлены А. Г. Катрухой, сотрудником Проблемной лаборатории химии ферментов, биофак МГУ, Москва) в разведении 1: 100 в течение 12 часов при 4С. После трехкратного промывания клеток ЗФР вносили конъюгат кроличьих антимышиных иммуноглобулинов с FITC в разведении 1:200 на 45 минут при комнатной температуре. После промывания клеток ЗФР на препараты наносили 60% раствор глицерина и закрывали их покровными стеклами. Фазовоконтрастную и флюоресцентную микроскопию проводили на микроскопе Laborlux фирмы Leika (Германия). Для фотографирования использовали цветную негативную фотопленку Fujicolor (Япония).

Наши исследования показали, что крысиные МСК при культивировании более двух месяцев в среде с 10% фетальной сывороткой и другими добавками, способны проявлять спонтанную дифференцировку в частности в направлении образования адипоцитоподобных клеток (рис.1.).

Из рисунка видно, что на ранних сроках культивирования имеет место фибробластоподобная морфология клеток. Однако при увеличении сроков культивирования и изменении рН среды, среди фибробластоподобных клеток монослоя спонтанно появляються адипоцитоподобные клетки с характерными жировыми включениями. Эти наблюдения позволяют считать, что воздействие веществ, влияющих на метаболизм МСК, может позволить добиться преимущественной дифференцировки этих клеток в требуемом направлении, как было показано [13].

При инкубировании крысиных МСК в течение 24 часов в среде, содержащей специальные факторы дифференцировки, на 2-3 день после их выделения и последующем культивировании в среде с добавлением факторов роста, к концу 2-ой недели в культуре наблюдается появление структур, напоминающих миотрубочки, поверх слоя фибробластоподобных клеток. Часть из которых (~1-2%), к концу 3-ей недели содержали от одного до нескольких ядер и спонтанно сокращались (рис.2.). При пересеве культур многоядерность клеток и их спонтанное сокращение пропадали и появлялись вновь, только после образования монослоя фибробластоподобных клеток. По-видимому, как и в случае с эмбриональными стволовыми клетками, получить чистую клонированную культуру дифференцированных клеток только в одном направлении не возможно и всегда должны присутствовать фидерные элементы, поддерживающие жизнеспособность и данную дифференцировку клеток.

Культивирование клеток, обработанных миогенными факторами дифференцировки в 0,2% агаризованной среде приводило к прекращению их роста и постепенной элиминации, что косвенно свидетельствует об отсутствии малигнизирующей способности этих культур.

При иммуногистохимическом исследовании культуры МСК, обработанной миогенными факторами дифференцировки, к концу 3-ей недели культивирования в 30-35% клеток выявляли специфический мышечный белок - тропонин-I с помощью моноклональных мышиных антител. Это свидетельствует о появлении значительного количества клеток начавших дифференцироваться в направлении мышечной ткани.

Таким образом, КМ является источником не только гемолимфопоэтических, но и мезенхимальных клеток, которым можно задать направление дифференцировки в нужном направлении в условиях in vitro. Это дает основание считать, что при введении клеток КМ в соответствующее микроокружение, предварительно выдержав в специфических условиях in vitro, они способны будут осуществлять заместительную и морфорегулирующую функцию на паренхиматозные ткани различных поврежденных органов. Исследование этих возможностей является предметом нашего дальнейшего поиска.

1. Онищенко Н.А., Базиева Ф.Х., Мамхегова Т.Р., Первакова Э.И.// К механизму восстановления функций пораженной печени с помощью устройств биоискусственной поддержки печени. //Трансплантология и искусственные органы. 1997, №4, с. 86-91.
2. Онищенко Н.А., Базиева Ф.Х., Иванова-Смоленская И.А. и др.// Экстракорпоральное подключение систем биоискусственной поддержки печени в комплексном лечении гепатоцеребральной дистрофии. //Вестник трансплантологии и искусственных органов. 1999, №1, с. 54-58.
3. Рябов С.И., Ракитянская И.А., Шутко А.Н.// «Почки и система иммунитета» //Л. Наука. 1989.
4. Шумаков В.И., Писаревский А.А., Онищенко Н.А. и др.// Коррекция нарушений гемостаза в организме при тяжелых формах печеночной недостаточности методами физико-химической и биологической детоксикации. //в кн. «Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов» Тула, «Репроникс Лтд.» 1998, с. 338-376.
5. Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н.// Трансплантация островковых и других эндокринных клеток. // в кн. «Трансплантология – руководство» М Медицина; Тула «Репроникс Лтд.» 1995, с. 317-331.
6. Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н.// Регуляция углеводного обмена и коррекция его нарушений при сахарном диабете. // в кн. «Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов» Тула, «Репроникс Лтд.» 1998, с. 93-118.
7. Deng W, Obrocka M, Fischer I, Prockop DJ.// In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP.// Biochem Biophys Res Commun 2001, V 282, N1, P. 148-152. Gruber R, Mayer C, Schulz W, Graninger W, Peterlik M, Watzek G, Luyten FP, Erlacher L.// Stimulatory effects of cartilage-derived morphogenetic proteins 1 and 2 on osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells. // Cytokine 2000, V12, N11, P. 1630-1638.
8. Linton M.F, Fazio S.// Macrophages lipoprotein metabolism and atherosclerosis: insights from murine bone marrow transplantation studies. // Curr. Opin. Lipidol. 1999, V10, N2, P. 97-105
9. Majumdar MK, Banks V, Peluso DP, Morris EA.//Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells.// J Cell Physiol 2000, V185, N1, P. 98-106.
10. Marusic A, Grcevic D, Katavic V, Kovacic N, Lukic IK, Kalajzic I, Lorenzo JA. // Role of B lymphocytes in new bone formation. // Lab Invest 2000, V.80, N11, P. 1761-1774.
11. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. et.al. // Bone Marrow as a Potential Source of Hepatic Oval Cells // Science. 1999, V.284, 14 May, P. 1168-1170.
12. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., et. al.// Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells // Science 1999, V.284, 2 april, P. 143-147.
13. Seshi. B, Kumar.S. Sellers.D.// Human Bone Marrow Stromal Cell: Coexpression of Markers Specific for Multiple Mesenchymal Cell Lineages //Blood Cells, Molecules, and Diseases 2000, V.26, N.3, June, P. 234–246.
14. Shmji Tomita, MD; Ren-Ke Li, MD, PhD; Richard D. Weisel, MD; Donald A.G. Mickle, MD; Eung-Joong Kim, MD; Tetsuro Sakai, MD; Zhi-Qiang Jia, MD. // Autologous Transplantation of Bone Marrow Cells Improves Damaged Heart Function // Circulation, November, 9, 1999.

вернуться к началу раздела